Flash效应是指利用超高剂量率(一般认为平均剂量率> 40 Gy/s)的射线短时间内大剂量照射某些实验动物时观察到的正常组织损伤小于同剂量常规剂量率照射，且肿瘤控制相当的效应。利用超高剂量率电离辐射实施的放射治疗也被称为Flash放疗。Flash放疗具有明显的放射生物学优势，有助于减少正常组织辐射不良反应，对具有强辐射抗性的肿瘤有很好的潜在治疗效果，且照射时间短，可以克服呼吸等运动对放疗造成的影响，是一种具有很大发展前景的放疗新模式。
本文重点关注Flash效应的机制研究。首先梳理了从超高剂量率相关实验到Flash效应发现的发展过程，突出二者之间的差异，以射线种类为线索介绍Flash效应动物实验模型的发展近况；然后从现象学出发，总结凝炼了Flash效应机制研究中需要回答的3个关键问题，并基于此分析了目前学界有关Flash机制的假说，主要介绍氧耗竭、自由基复合和免疫细胞保护3类假说的内容及研究现状；最后总结Flash效应相关研究的现状与挑战，为相关合作与发展提出建议。
一、超高剂量率相关实验与Flash效应
在使用相同种类和总剂量的射线时，剂量率(或者说照射时间)这一物理量是Flash照射和常规剂量率照射的最大的差别。自20世纪50年代开始就有多个研究组开展了一系列超高剂量率离体细胞实验，发现脉冲束流照射下的细胞(包括细菌[1]、HeLa细胞[2-3]、CHO细胞[4-6])存活分数高于同剂量常规剂量率，细胞放射敏感性下降。2022年Adrian等[7]使用脉冲电子束照射胰腺癌细胞亦出现该现象。
值得注意的是，虽然都与超高剂量率照射相关，但Flash效应并不等同于上述超高剂量率相关实验，二者不论在生物体环境、现象还是机制方面都有明显差异。超高剂量率相关实验引发了放射生物学对剂量率因素的关注，但其研究对象是离体细胞，直到2014年，法国居里研究所的Favaudon等[8]分别使用超高剂量率和常规剂量率电子束照射荷瘤小鼠，发现超高剂量率组的小鼠肺纤维化程度普遍轻于常规剂量率组，而肿瘤控制效果相当。根据其短时间大剂量的物理特性，该现象被命名为Flash效应，是活体环境下超高剂量率照射后正常组织损伤减小、肿瘤控制率不变的差异化响应。在机制方面，目前学界普遍认同超高剂量率相关实验现象的机制是氧效应，即超高剂量率照射瞬时消耗培养液内大部分氧气，细胞因乏氧而产生放射抗性[9]，而Flash效应机制尚处于探索阶段，明确二者的差异正是开展Flash效应机制研究的前提，这也是本文提出Flash效应机制3个关键问题的出发点之一。
二、不同射线诱发的Flash效应动物模型和临床试验
为了进一步确认Flash效应的广泛存在，研究者使用不同类型的射线、动物和组织器官开展实验，并从中寻找特征参数。
1. 电子：电子是最早观察到Flash效应且动物实验最为丰富的射线类型，照射部位包括小鼠脑部[10-14]、腹部[15-17]、皮肤[18]、胸肺[19]以及血液[20]，大型哺乳动物皮肤(迷你猪和猫[21]、狗[22])，以及发育生物体(斑马鱼卵[23-25])。2019年Bourhis等[26]对一位放射敏感性皮肤癌患者实施电子Flash放疗，照射后局部皮肤反应较轻，这也是首例Flash放疗临床试验，随后进一步对该患者两侧手肘皮肤分别实施相同剂量的常规和Flash放疗[27]，急性和远期放射不良反应均未见显著差异。电子Flash效应实验存在阴性报道，Venkatesulu等[28]用35 Gy/s电子束照射小鼠心脏、脾脏以及腹部，结果表现出更严重的免疫细胞损伤和辐射致肠胃不良反应，小鼠存活率也远低于常规剂量率。由于电子穿透性不足，低能电子束难以实现人体深部肿瘤的照射，制约了其临床发展前景。
2. 光子：光子穿透能力强，更容易实现人体深层肿瘤照射，是Flash放疗更理想的粒子种类。而受到实验条件限制，当前光子Flash动物实验的照射物种和部位都还有限。根据产生途径和能量级别将用于Flash实验的光子束流分为两类：同步辐射产生的kV级低能光子束和加速器电子束打靶产生的MV级高能光子束。瑞士团队Montay-Gruel等[29]和法国SOLEIL同步辐射光源中心合作，基于欧洲同步辐射装置(ESRF)产生的同步辐射光子(102 keV)对小鼠全脑实施10 Gy超高剂量率(37 Gy/s)照射，首次证实了X射线能够诱发Flash效应。而Smyth等[30]使用37~41 Gy/s的124 keV同步辐射光子对小鼠分别实施全身、全腹和全脑照射，均未见Flash效应，表明光子Flash效应的触发物理条件还有待进一步探究。
kV级低能光子仍存在穿透性不足的问题，因此，发展MV级光子Flash放疗是未来趋势。中国工程物理研究院的超导电子加速器首次实现MV级高能光子超高剂量率动物照射，在荷瘤小鼠和正常小鼠的胸腔和全腹照射中均观察到了Flash效应[31-32]。苏州大学Shi等[33]利用该束流平台照射PD-L1基因敲除小鼠腹部，肠胃损伤明显减轻，但对于野生型小鼠两种剂量率照射下正常组织损伤相当，未见Flash效应。
3. 质子和重离子：2019年Differender等[34]用78 Gy/s的质子束对小鼠实施全腹照射，首次观察到质子Flash效应。随后，在小鼠肺部[35]、皮肤[36-37]、四肢[38]和大脑[39]的实验模型中均观察到质子Flash效应。质子Flash实验也存在阴性报道，Beyreuther等[40]用100 Gy/s质子束照射斑马鱼卵却未能诱发Flash效应。在临床试验方面，美国辛辛那提儿童医院对10位四肢骨转移癌症病患开展穿透式质子Flash治疗(FAST-01)[31]，治疗后3个月的随访结果显示轻微的不良反应，证明了Flash质子放疗的可行性[41]。
重离子Flash动物实验的发展较晚，目前鲜有文献报道观察到Flash效应。2021年Tinganelli等[42]用240 MeV/n的碳离子对小鼠后腿部肉瘤实施150 Gy/s超高剂量率照射，小鼠的肌肉形变程度降低，且较少出现肺部转移瘤。
三、Flash效应机制的3类假说
Flash效应机制研究的核心问题是解释短时间大剂量照射这一物理特征与正常组织损伤、肿瘤控制等生物效应的关系。本文从现象学出发，将Flash效应机制抽象为3个关键问题。
首先，面对大量动物实验中出现的正常组织损伤小和肿瘤控制率不变的差异性响应，很自然地可以提出问题1和问题2：为什么超高剂量率照射造成的正常组织损伤小于同剂量的常规剂量率照射；为什么超高剂量率照射的肿瘤控制与常规剂量率相当。进一步针对超高剂量率相关实验和Flash效应的差异，提出问题3：为什么超高剂量率照射体内肿瘤组织和体外癌细胞存在差异性响应，这也是Flash机制的全面解释中不可或缺的部分。
自从Flash效应发现以来，学界提出了大量假说来揭示其背后的放射生物学机制，尝试建立从物理特征到生物效应的机制链，主要可以分为3类：氧耗竭、自由基复合和免疫细胞保护。本部分系统梳理了这3类假说的提出和发展脉络，并结合3个关键问题展开分析。
1. 氧耗竭假说：20世纪大量超高剂量率离体细胞实验揭示了氧气与细胞辐射敏感性之间的关系，基于氧效应，学界提出了氧耗竭假说，认为短时间大剂量照射迅速消耗了组织细胞内的氧气，使得细胞处于乏氧状态，降低了细胞的辐射敏感性，从而减小组织损伤。表 1中列出了一些氧耗竭假说的支持模型，通过实验或模拟计算探究超高剂量率照射与细胞放射性氧消耗以及活性氧物质(reactive oxygen species, ROS)产额等量之间的关系。
表 1(Table 1)
表 1 氧耗竭假说支持模型
Table 1 Supportive models of oxygen depletion hypothesis
类型
研究者
实验/模拟对象
支持论据
实验
Montay-Gruel等[10]
小鼠和斑马鱼卵
辐照时吸入高氧对小鼠认知功能有负影响；加入抗氧化剂的鱼卵能减弱辐射对其发育的负影响
模拟
Pawelke等[23]
斑马鱼卵
Flash照射后细胞氧浓度骤然下降，对鱼卵发育的损伤影响小于常规剂量率
Spitz等[43]
与氧含量相关的ROS产额
肿瘤组织内源铁离子(Fe2+)含量相对正常组织更高，催化过氧化物发生芬顿反应产生自由基(HO·、ROO·等)，并形成链式反应产生更多ROS，抵消了因氧消耗而引发的损伤降低
Pratx和Kapp[44]
氧含量
Flash照射引发组织中的缺氧干细胞氧耗竭，辐射损伤减小，从而避免组织的细胞增殖能力遭到破坏
Petersson等[45]
氧含量
Flash照射引发低氧合细胞氧耗竭
Zhu等[46]
氧含量
Flash照射引发低氧合细胞氧耗竭
注：ROS. 活性氧物质
表 1 氧耗竭假说支持模型
Table 1 Supportive models of oxygen depletion hypothesis
氧耗竭假说的核心在于认为Flash照射能使体内组织细胞达到氧耗竭水平，而这一点受到了诸多质疑[47]。氧含量取决于单位剂量电离辐射引发的氧消耗量和氧恢复特征时间，这些参数的取值存在争议，这也影响了氧耗竭模型结论的可靠性。单位剂量辐射消耗的氧气量并没有确定结论，根据20世纪70年代的实验数据[6]，1 Gy大概消耗0.44 μmol/L氧气(即0.44 μmol ·L-1 ·Gy-1)，而根据Cao等[48]的测量结果，体内正常组织的辐解氧消耗量大概为0.3 μmol ·L-1 ·Gy-1，体内肿瘤则大约只有0.05 μmol · L-1 ·Gy-1。组织内氧恢复速率则取决于血管密度，大多模型仅采用单血管进行模拟计算，与真实情况差异较大。基于不同的参数设置，一些实验[8, 48-49]和计算[50-51]结果显示Flash照射无法引发细胞氧耗竭，Hu等[52-53]根据脑的氧摄取速率和血管密度建模计算了脑的氧含量分布和照射后随时间的变化，结果表明Flash照射无法使脑细胞达到氧耗竭程度。
2. 自由基复合假说：Flash效应是一种放射生物学效应，而电离辐射在引发生物效应之前，必定有相应的辐射化学变化[54-55]。电离辐射作用于生物分子后会产生大量有机自由基(R·)，以及氧化后的有机过氧自由基(ROO·)，短时间大剂量照射对机体内自由基反应份额的改变可能是Flash效应的原因[56]。
2020年Labarbe等[57]提出自由基复合假说，首次从电离辐射后自由基相关化学反应出发解释Flash效应机制，采用化学反应动力学作为研究方法，寻找诱发Flash效应的关键化学反应。由于Flash照射短时间大剂量的特性，受照部位的有机过氧自由基瞬时浓度增加，发生自由基复合反应的比例随之增加，同时终止自由基链式反应。由于相同剂量的辐射产生自由基数量的总和是基本不变的，Flash照射增加了自由基复合比例，从而减少了高活性的自由基对正常组织的攻击，降低正常组织损伤。
为了进一步解释问题2和问题3，Hu等[58]提出自由基复合-抗氧化剂假说，认为抗氧化剂含量或是体内肿瘤和正常组织Flash照射差异性响应的关键因素。自由基除了攻击生物分子或发生复合反应，还会与体内的抗氧化剂反应，与正常组织和体外癌细胞培养环境相比，体内一些肿瘤及其微环境的抗氧化剂含量较高[59]，自由基复合反应占比较少，因此Flash照射引发的自由基瞬时浓度变化对其各反应份额没有显著影响，保证了肿瘤组织的杀伤效果。由于不同类型的肿瘤组织微环境相差较大，该假说的适用性需要进一步实验验证。
3. 免疫细胞保护假说：电离辐射造成受照部位特定组织器官细胞损伤，同时引发机体免疫系统应激响应，免疫系统响应在放疗正常组织不良反应和肿瘤控制效果中具有重要作用。Jin等[60]提出免疫细胞保护假说，认为在相同剂量条件下，Flash照射时间短，血液循环中因受到照射而损伤的淋巴细胞数量将显著低于常规剂量率，减轻了对机体免疫保护屏障的破坏，有助于受损组织细胞的自我修复，进而降低组织损伤水平。
免疫细胞保护假说认为Flash照射减少了血液循环免疫细胞损伤数量，而这一结论仅是理论计算的结果。在实验方面，Venkatesulu等[28]用35 Gy/s电子束照射小鼠心脏和脾脏后定期检测外周血淋巴细胞数量，发现Flash照射组小鼠的淋巴细胞下降更多，且远期恢复情况更差。该阴性实验结果对免疫细胞假说提出了挑战，同时，免疫细胞对受照正常组织的影响并不明确，其中涉及复杂的机体免疫响应过程，免疫细胞保护假说还需进一步研究。
四、总结与展望
大量预临床动物实验发现并确认了不同射线超高剂量率照射特定动物、组织、肿瘤中存在Flash效应，为Flash效应的机制解释和Flash放疗的临床实践提供了大量实验依据[61]。一些动物实验更进一步探究了触发Flash效应的关键特征参数，如剂量率[11, 28]、脉冲结构[25]以及剂量分割模式[12]等。
目前Flash动物实验仍面临诸多挑战。超高剂量率束流发生装置还处于发展中，实验多集中于穿透能力较弱的低能电子，高能电子和MV级X射线束流的Flash实验模型较少，且硬件导致的束流不稳定和射野剂量不均匀都将带来较大的实验误差。Flash照射下的荷瘤动物实验很少，多数仅讨论了正常组织损伤，需要建立能够同时验证Flash照射下正常组织和肿瘤差异响应的动物实验模型。存在一些Flash效应阴性实验结果的报道，Flash效应的关键特征参数及其对不同部位、肿瘤类型的适用性有待进一步研究确认。
Flash效应机制研究正处于发展中。根据Flash照射短时间大剂量的物理特性，3类机制假说尝试从不同角度解释Flash效应，但都还无法完善地回应3个关键问题。同时从机制研究方法而言，不论是实验还是模拟手段都面临着巨大挑战。氧耗竭假说需要更准确的测量手段来确定机体内的电离辐射引发的瞬时氧气消耗和恢复速率，以应对氧气是否耗竭的质疑。自由基复合相关假说的计算和验证也面临困难，自由基寿命极短且反应复杂，相关反应速率的实验数据难以获取，基于化学反应动力学的计算需要明确细胞内的化学组成和更为准确的反应类型及速率作为支撑[62]。
Flash效应相关研究涉及多个领域，2020年欧洲成立了联合研究项目UHDpulse[63]，在超高剂量率发生装置、剂量测量、机制研究等诸多方面展开合作。鉴于Flash效应的临床前景和我国癌症放疗的巨大需求，需要建立不同学科背景的研究团队，多种研究手段相结合，提取主要因素，从简单到复杂，逐步揭示Flash效应机制，从而指导Flash放疗的临床发展应用。
利益冲突 无
作者贡献声明 周婉仪负责文献搜集、整理和论文撰写；胡安康负责文献搜集和论文撰写；邱睿和李君利指导论文修改